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Modellierung und Simulation

Arbeitsgruppe 8.41

Streuprobleme in der Durchflusszytometrie

Ein neuer Anwendungsbereich unserer Arbeitsgruppe ist die Modellierung für die optische Durchflusszytometrie. Bei der optischen Durchflusszytometrie wird Licht an menschlichen Blutzellen, wie z.B. den roten Blutkörperchen (Erythrozyten), gestreut, um aus den gemessenen Streulichtverteilungen Rückschlüsse auf die zu charakterisierenden Blutzellen ziehen zu können. Zellvolumen und Geometrieparameter der Zellprofile lassen sich aus den Streudaten durch die numerische Lösung eines inversen Problems bestimmen. Für die verlässliche Berechung der Zellgeometrie mit geringen Unsicherheiten sind raumwinkelaufgelöste Streulichtmessungen erforderlich. Existierende Referenzmessfahren zur Bestimmung von Zellvolumina sollen dadurch erweitert werden.

Einleitung

Abbildung 1: Schemazeichnung zur Funktionsweise eines optischen Durchflusszytometers.

Die optische Zytometrie, also die Untersuchung von biologischen Zellen mithilfe von Lichtstreuung ist ein im Laboralltag routinemäßig genutztes Verfahren zur Zellzählung und -charakterisierung. Es kommen sogenannte Durchflusszytometer zum Einsatz: Die zu untersuchende Zellsuspension fließt durch eine enge Küvette und wird dort mithilfe einer laminar strömenden Hüllflüssigkeit auf einen Querschnitt von einigen Mikrometern Ausdehnung hydrodynamisch fokussiert. Im Vorbeifließen wird die Probe mit einem Lichtstrahl (Laser) beleuchtet und das von den Zellen gestreute Licht durch eine geeignete Optik auf einen Detektor geleitet. Die Lichtwellenlänge liegt typischerweise im sichtbaren Bereich (z. B. 633 nm oder 488 nm). Aufgrund der hydrodynamischen Fokussierung passieren die Zellen den Lichtfokus einzeln (Abb. 1). Die genaue Gestalt des gestreuten Lichtfeldes hängt dabei von den Eigenschaften der Zelle ab, wie etwa Größe, Form und Brechungsindex. Ziel des indirekten Messverfahrens ist ein Rückschluss von der Streulichtverteilung auf die Eigenschaften der Zelle.

Durchflusszytometrische Messverfahren kommen auch bei der Untersuchung von Blutproben zum Einsatz, etwa bei der Erstellung von Blutbildern. Die Modellierung der Lichtstreuung an menschlichen Blutzellen wie z.B. den roten Blutkörperchen (Erythrozyten; häufigster Typ von Blutzellen) bildet zusammen mit der numerischen Lösung des inversen Streuproblems einen wichtigen Baustein für die optische Durchflusszytometrie, um aus gemessenen Streulichtverteilungen Rückschlüsse auf die zu charakterisierenden Blutzellen ziehen zu können. In herkömmlichen Verfahren werden meist Detektoren verwendet, die die Lichtintensität um einige wenige Richtungen aufintegrieren. Gemessen wird also z.B. Vorwärts- und Seitwärtsstreuung. Um Zelleigenschaften wie Volumen Volumina und/oder Geometrieparameter verlässlich und mit geringer Unsicherheit zu bestimmen, ist aber mehr Information und somit raumwinkelaufgelöste Streulichtmessungen erforderlich. Existierende Referenzmessfahren zur Bestimmung von Zellvolumina sollen dadurch erweitert werden.

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Modellierung

Grundlage für die mathematische Modellierung der Lichtstreuung an Blutpartikeln sind die Maxwellgleichungen. Im Falle zeitharmonischer elektromagnetischer Felder (monochromatisches Licht) und homogener Medien (Brechungsindex $n$) vereinfachen sich diese zur Vektor-Helmholtz-Gleichung \[\Delta {\bf E} + k_0^2\,n^2{\bf E} = 0\] für das elektrische Feld ${\bf E}$ bzw. analog für das magnetische Feld ${\bf H}$. Die Lösung wird in der Form \[ {\bf E} = {\bf E}^i + {\bf E}^s \]gesucht, wobei ${\bf E}^i$ die einfallende Welle und ${\bf E}^s$ die gestreute Welle ist. Die Zelle wird dabei im einfachsten Fall als Gebiet homogenen Brechungsindex' angenommen. Eine analytische Lösung existiert nur für Spezialfälle wie etwa die Streuung einer ebenen Welle an einer homogenen Kugel (Mie-Streuung) oder im Grenzfall kleiner Streuer (Rayleigh-Streuung). Für allgemeinere Fälle, bei denen die streuenden Partikel bzw. Blutzellen eine von der Kugel abweichende Form besitzen, existieren verschiedene numerische Verfahren wie z.B. die diskrete Dipol-Approximation (DDA). Hierbei wird das Volumen des Streuers diskretisiert und die Subvolumina durch Dipolmomente beschrieben. Das Resultat ist ein lineares Gleichungssystem für gekoppelte diskrete Dipole, das dann numerisch gelöst wird. Als Ergebnis wird die Amplituden- bzw. die Müllermatrix des Streulichtfeldes für den interessierenden Raumwinkelbereich berechnet, und zwar in Abhängigkeit vom einfallenden Wellenfeld und vom Brechnungsindex (Kontrast) der Zelle. Für die DDA existieren leistungsfähige Implementierungen. Um sie anwenden zu können, müssen die angenommenen Formen der Blutzellen geeignet modelliert werden. Die bikonkave Plättchenform ist hierfür ein aussichtsreicher Kandidat, um realen Verhältnissen möglichst nahe zu kommen. Allerdings können Verformungen durch hydrodynamische Kräfte, thermische Fluktuationen oder pathologische Zellformen (z.B. Sichelzellen) diese Geometriemodellierung noch aufwendiger machen. Offene Fragen bestehen auch noch bei der Wellenlängenabhängigkeit des Brechungsindex’ der roten Blutzellen. Es existieren verschiedene, teils widersprüchliche Literaturwerte. Außerdem hängt der Brechungsindex von der Hämoglobinkonzentration innerhalb der einzelnen Erythrozyten ab. Deshalb müssen auch Messungen des spektralen Verlaufs der Extinktion von Erythroztensuspensionen ausgewertet werden, um verlässliche und möglichst genaue Werte für den Verlauf des Brechnungsindex der roten Blutzellen in Abhängigkeit der Wellenlänge zu bekommen.

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Simulation - das virtuelle Experiment

Abbildung 2: Vereinfachtes bikonkav-scheibenartiges Formmodell für Erythrozyten. Einheiten skaliert.

Ein leistungsfähiges Vorwärtsmodell zur Simulation der Messsituation der optischen Durchflusszytometrie ist ein starkes Instrument zur Verbesserung bzw. Weiterentwicklung der Messverfahren. Die Empfindlichkeit der Streusignale auf Variation verschiedener Modellparameter kann mit Simulationsrechnungen umfassend untersucht werden. Auch statistische Einflussgrößen wie z.B. zufällige Schwankungen der einzelnen Zellgeometrien um einen Mittelwert, Rauigkeit der Zelloberflächen, Inhomogenitäten des Brechnungsindex im Zellinneren, können in ihren Auswirkungen auf die zu erwartenden Streulichtverteilungen quantifiziert werden. Abb. 3 und Abb. 4 zeigen Intensitätsverteilungen, die mit Hilfe der Methode der diskreten Dipol-Approximation (DDA) für das Formmodell  aus Abb. 2 berechntet wurden.

Abbildung 3: Mit DDA simulierte Intensitätsverteilungen um die Vorwärtsrichtung für ein bibonkav- scheibenartiges Erythrozytenmodell. Lichteinfall entlang z-Achse, aus der Bildebene heraus. Von links nach rechts Rotation um die $x$-Achse: 0° (Scheibe quer zum Lichtstrahl), 46°, 90° (Scheibe schmalseitig zum Lichtstrahl). Zelldurchmesser 6,7 µm, Wellenlänge 488 nm, relativer Brechungsindex 1,06+0,0011i.

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Inverses Problem - Rückschluss auf Form und Volumen

Um aus den gemessenen Streudaten im Rückschluss Informationen z.B. über die Form der Zellen und ihr Volumen zu bekommen, ist die Lösung des inversen Streuproblems notwendig: Wie muss ein Streuer beschaffen sein, um eine gegebene Fernfeld-Lichtverteilung (Abb. 3 und Abb. 4) zu erzeugen? Dieses inverse Problem wird als Optimierungsproblem gelöst, d.h. es geht darum, mittels Variation denjenigen Parametersatz (Geometrieparameter, Materialeigenschaften) des mathematischen Modells der Zelle zu finden, dessen zugehörige Streulichtverteilung die gemessene am besten reproduziert. Im Allgemeinen ist dieses inverse Problem schlecht gestellt, so dass man ohne Regularisierung, etwa durch Einschränkungen für die zugelassenen Formmodelle, ihre Parameterbereiche bzw. ihre Brechungsindex-Verteilungen nicht zum Ziel kommen wird. Die Eignung verschiedener Optimierungsansätze wie z.B. Least-Squares, Maximum-Likelihood oder Bayes’sche Verfahren kann mit mit unterschiedlich verrauschten Simulationsdaten sehr gut untersucht werden.

Abbildung 4: Mit DDA berechnete laterale Lichtintensitätsverteilung eines bikonkaven roten Blutköperchens für zwei verscheidene Orientierungen relativ zum einfallenden Licht; Wellenlänge 488 nm; relativer Brechungindex 1,06.

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