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Neuer Ansatz zur quantitativen Bestimmung von Hämoglobin in Humanserum

04.06.2015

Im Rahmen des EMRP-Projektes HLT05 (Metrology for metalloproteins) wurde eine neue, auf der Ramanspektrometrie basierende Methode entwickelt, um Hämoglobin (Hb) im Humanblut zu bestimmen. Durch die Verwendung eines isotopenmarkierten internen Standards (ID-Raman) wird die Rückführung der Resultate auf das SI im Sinne eines primären Referenzverfahrens gewährleistet. Dies bedeutet, dass der der Analyt eindeutig identifiziert und quantifiziert werden kann.

Verbindliche Ringversuche zur klinischen Analytik, die durch die Richtlinie der Bundesärztekammer (RiLiBÄK) vorgegeben sind, zeigten in den letzten Jahren, dass viele in klinischen Laboratorien eingesetzte Untersuchungskits zum Teil sehr unterschiedliche Analysenergebnisse liefern. Viele ärztliche Diagnosen stützen sich jedoch genau auf solche Ergebnisse. Daher ist es unabdingbar, vergleichbare und zuverlässige Methoden zur Quantifizierung der Hb-Konzentration zu entwickeln, die auf das SI rückführbar sind. Im Rahmen des Projektes wurde dazu eine spezies-spezifische ID-Raman Methode entwickelt, bei der eine Probe mit einem Isotopolog des Hämoglobins als internen Standard versetzt wird.

Zunächst werden Ramanspektren von Lösungen mit natürlichen Hb, isotopisch verändertem Hb sowie mehrerer, definierter Mischungen beider Lösungen aufgenommen und aus den Spektren ein Partial Least Squares (PLS) Modell erstellt. In weiteren Schitten werden die Probe und eine der Probe ähnliche, vollständig charakterisierte Referenz mit dem Standard versetzt und aus den gemessenen Ramanspektren mit Hilfe des PLS Models die Hb Konzentration der Probe bestimmt.

Links: Bändermodell von Hämoglobin A (Quelle: Protein Data Bank, PDB). Mitte: Tropfen aus 0,3 µL Erytrozytenkonzentrat bei 10facher Vergrößerung. Das Hämoglobin konzentriert sich beim eintrocknen im roten Randbereich. Rechts: Ramanspektren der beiden reinen Isotopologe sowie einer 1:1-Mischung.