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Metrologie für die molekulare und zelluläre Medizin: Notwendigkeit und Herausforderung

PTB-Mitteilung 2008, Heft 4

Metrologie für die molekulare und zelluläre Medizin: Notwendigkeit und Herausforderung

Rainer Macdonald

Bedeutende Fortschritte im Verständnis der molekularen sowie der zellbiologischen Ursachen von Krankheiten führen in zunehmendem Maße zu neuen, vielversprechenden medizinischen Diagnoseverfahren und Therapieansätzen, die unter den Schlagworten „molekulare“ und „zelluläre“ und Medizin subsummiert werden können. Die Vorteile, speziell der molekular-medizinischen Diagnostik, beruhen vor allem auf einer hohen Nachweisempfindlichkeit und Spezifität. Bereits heute ist absehbar, dass die bedeutenden Schlüsselinnovationen der nächsten zehn Jahre auf diesem Gebiet der Medizin zu erwarten sind.

Reference Procedures for the Determination of Cell Concentrations in Body Fluids

Jörg Neukammer, Manuela John, Andreas Kummrow, Stephan Reitz, Sandra Schädel, Karin Schulze, Klaus Witt

In support of medical diagnosis the concentration of different cells in body fluids has to be known with high accuracy. In the working group "Flow Cytometry and Microscopy" of the Physikalisch-Technische Bundesanstalt (PTB) reference procedures have been developed to determine reference values for the measurands of the Complete Blood Count (CBC). The reference values for the concentration of erythrocytes, platelets and leukocytes as well as the concentration of haemoglobin and the haematocrit value are provided by the PTB to evaluate round robin tests organised by German medical associations. In Germany, participation of clinical laboratories for external quality control is mandatory and regulated by the Guidelines of the German Medical Association (Richtlinien der Bundesärztekammer, RiLiBÄK). In addition, the maximal admissible deviation from target values determined by reference laboratories is defined in the RiLiBÄK.

In flow cytometry, blood cells are detected and differentiated by impedance changes, light scatter or fluorescence signals when passing the measuring sensor or interaction zone. Depending on the instrumental design, count rates between several 100 Hz up to 10 kHz can be obtained. To derive reference measurement values for the concentration of cells, the procedures developed at the PTB are based on gravimetrically controlled volume measurements in combination with serial dilutions to correct for coincidence loss as well as cell loss, e.g. due to adhesion. The method relies on the measurement of the cell concentration as function of the volume fraction of the (blood) sample in the measurement suspension and extrapolation to zero volume fraction. Studies on coincidence loss and correction by serial dilutions were accomplished by several author decades ago utilizing the Coulter principle, i.e. resistive pulse detection. This method of coincidence correction is not only suited for impedance cell counters but can also be applied for dead time correction in optically based instruments where cell differentiation is achieved by light scatter or fluorescence of immunologically stained cells.

It is important to point out that the counting loss due to the dead time not only depends on the instrument but also on the size and the rheological properties of the cells. Hence, calibration of the respective instrument is not sufficient and the determination of reference measurement values requires the preparation of a dilution series for each blood sample. The modus operandi to derive reference values of concentrations of erythrocytes and leukocytes is described in German standards and recommended by the International Council for Standardisation in Haematology (ICSH). The series of German standards concerning the complete blood count also includes reference procedures to determine the haemoglobin concentration in blood, blood collection and sample preparation, characteristic quantities for erythrocytes and the determination of the packed cell volume by centrifugation. In addition, a reference procedure to determine platelet concentrations is described, which includes specific immunological staining to identify the target cells.

Development of microfluidic structures for flow cytometric blood cell differentiation

Marcin Frankowski, Andreas Kummrow and Jörg Neukammer, Andrej Tuchscheerer and Martin Schmidt

Over the last decade, flow cytometry, a well established high throughput diagnostic tool in haematology and immunology, entered a new phase of its evolution taking advantages of the rapidly developing area of microtechnology. The new approach incorporates compact designs based on on-chip integrated measurements in order to determine physical and biological properties of cells and intracellular constituents. In addition, the process of sample preparation can be included as well. Thus, differentiation of single biological particles can be performed in complex while compact microchips integrating fluidics, electrical connectors (electrodes) and optics, which allow particle counting by measuring impedance changes, light scattering and fluorescence (following immunological staining). In effect, several prototype devices allow counting biological cells in microfluidic platforms, the flow channels of which have widths of few hundred micrometers down to tens of micrometers size. Used as cartridges for dedicated readout instruments, such disposable microchips could be applied in sterile environments, e.g. during surgery to determine platelet concentration before initiating blood transfusion. Well defined operational parameter ranges for sample volumes and flow rates may provide standardized protocols for complex flow cytometric analyses resulting in better reproducibility and possibly better accuracy of measurements. Furthermore, microfluidic devices can be optimized for specific tasks, like for instance reliable determination of cells concentrations to classify the severity of HIV and malaria. This facilitates applications ranging from point-of-care analyzers for emergency services to portable bedside instruments for rapid and accurate diagnosis at home. Recent technological achievements have already proven an ability to deliver a analytical apparatus based on a variety of microfluidic platforms. Future efforts will aim at developing microchips and read out instruments which can be handled by non-qualified personal, which then would further reduce service demands, especially in developing countries.

Mehrkomponentenmessungen der mechanischen Größen Kraft und Moment

Sandra Schädel, Andreas Kummrow, Jörg Neukammer

Eine Blutanalyse aus diagnostischen oder therapeutischen Gründen kann für jeden betroffenen Patienten lebensrettend sein. Voraussetzung hierfür ist eine zuverlässige klinische Routineanalytik. Die Grundlage für die vertrauenswürdige Angabe verschiedener Messgrößen in der Medizin bildet die Rückführung medizinischer Messungen auf nationale Normale oder die Charakterisierung von Kontrollmaterialien mittels Referenzverfahren. Mindestanforderungen an die Messgenauigkeit von Analysen sowie deren Kontrolle und Bewertung werden in der „Richtlinie der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung quantitativer laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen“ festgelegt.

Die PTB ermittelt beispielsweise für die seit 2002 vorgeschriebenen Ringversuche zum „Kleinen Blutbild/ldquo; Referenzwerte für die Konzentrationen der Erythrozyten (rote Blutkörperchen), Thrombozyten (Blutplättchen) und Leukozyten (weiße Blutkörperchen). Diese Werte werden von den medizinischen Standesorganisationen bei der Durchführung der Ringversuche zur externen Qualitätssicherung der hämatologischen Laboratorien Deutschlands verwendet.

Validierung eines "Fluorescent Enzyme Linked Immuno Sandwich Assay" (ELISA)

Jan Voigt, Bernd Ebert, Angelika Hoffman und Rainer Macdonald

Immunologische Verfahren haben während der vergangenen Jahrzehnte eine große Verbreitung in der Medizin gefunden. Grundlage dieser Verfahren ist die spezifische Bindung zwischen Antigen und Antikörper. Eine der wichtigsten Methoden zum sensitiven und quantitativen Nachweis biologisch relevanter Moleküle ist hierbei der Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Unter dem Aspekt der zahlreichen Einsatzgebiete ist die Frage nach Messunsicherheiten bei der Konzentrationsbestimmung von Biomolekülen mittels ELISA aus metrologischer Sicht von großem Interesse. Eine erhebliche Herausforderung stellt hierbei die Vielzahl von Einflussgrößen dar, die zudem hinsichtlich ihrer Messunsicherheit nur schwer zu quantifizieren sind. In Hinblick auf den Einsatz der Assays im Bereich der Laboratoriumsmedizin besteht die Notwendigkeit, Genauigkeit und Zuverlässigkeit dieser Messverfahren zu validieren. Zu diesem Zwecke wurden im Rahmen einer CCQM-Studie (CCQM- Comité consultatif pour la quantité de matiè re - métrologie en chimie ) internationale Vergleichsmessungen an einem ELISA zur Zytokinbestimmung (humanes Interferon-a) durchgeführt, an denen sich die PTB beteiligt hat.

Mikroskopisches Messverfahren für nanometrische Abstandsmessungen an einzelnen Makromolekülen unter nativen Bedingungen

Steffen Rüttinger, Volker Buschmann, Martin Roos

Bereits 1944 verwies Erwin Schrödinger in seinem Buch „Was ist Leben“ auf die fundamentalen Unterschiede zwischen Systemen, die die klassische Physik studiert und biologischen Organismen. Anders als in stark geordneten Systemen wie z.B. Atomen oder Kristallen, bei denen aus der Eigenschaft des Ensembles auf die Eigenschaft eines Ihrer Bestandteile geschlossen werden kann, sind entsprechende statistische Aussagen zu einfach für komplexe lebende Systeme. Beispielsweise können verschiedene Kopien eines Proteins oder DNS Stranges nebeneinander in verschiedenen, kurzlebigen, gefalteten Zuständen existieren. Messungen an einem Ensemble zur Strukturanalyse würden nur einen Durchschnitt ergeben, jedoch nicht eine einzige der wahren und für ihre Funktion essentiellen Struktur offenlegen.

Seither wurden viele Forschritte erzielt und heute gilt die wichtige Hypothese, dass durch Identifizierung und Quantifizierung geeigneter Parameter das Verständnis von biologischen Systemen verbessert werden kann. Der Zustand einer Zelle kann zum Beispiel mit der Anzahl oder der Konformation (gefaltet oder nicht gefaltet) eines bestimmten Proteins verknüpft sein. Die Messaufgabe würde dann darin bestehen, dieses Protein zu quantifizieren oder dessen Konformation zu bestimmen. Der Zustand der Zelle kann also durch geeignete Einheiten, wie zum Beispiel die Anzahl des ausgewählten (und sich in einem speziellen Zustand befindlichen) Proteins ausgedrückt werden. Als fundamentale Einheit bietet sich in solchen und ähnlichen Fällen also ein einzelnes Molekül geradezu an.

Hierfür sind Methoden und Messverfahren zum Nachweis und zur Detektion einzelner Moleküle erforderlich, deren grundsätzlicher Vorteil bereits angedeutet wurde: ihre inhärente Möglichkeit quantitative Ergebnisse zu erzielen. In biologischen Systemen sind einzelne Moleküle (z.B. Proteine aber auch DNS) die kleinsten funktionellen Einheiten, gleichzeitig können diese kleinsten Einheiten vollständig die Funktion und Entwicklung eines biologischen Systems bestimmen (z.B. kann ein DNS Molekül alle für eine Zelle notwendigen Informationen kodieren).

In diesem Artikel wird eine ausgewählte und an der PTB weiterentwickelte Einzelmolekülmethode, nämlich die Abstandsmessung mittels resonantem Förster Energietransfer (Förster Resonant Energy Transfer – FRET) vorgestellt. Mittels FRET lassen sich inter- und intramolekulare Abstände in der Größenordnung von wenigen Nanometern unter nativen Bedingungen messen. Dies lässt sich ausnutzen, um Kolokalisierungen von Molekülen aber auch Faltungszustände von Proteinen nachzuweisen. Von besonderem Interesse ist dabei unter metrololgischen Gesichtspunkten eine Evaluierung der Genauigkeit und der Grenzen dieser Methode auf Einzelmolekülniveau.

Fluoreszenzgestützte molekulare Bildgebung in vivo

Bernd Ebert, Kai Licha

Die molekulare Bildgebung repräsentiert ein modernes Forschungsgebiet, das die Aufklärung des Ablaufs molekularer biologischer Prozesse mit Hilfe geeigneter Sonden und dessen Visualisierung in vivo ermöglicht. Diese Technik der Bildgebung kann - abgesehen von der Injektion von Kontrastmitteln - als nicht-invasiv bezeichnet werden. Um ein möglichst genaues Abbild der Prozesse auf zellulärer Ebene in vivo zu erhalten, dürfen Einflüsse der verwendeten Sonden auf die biologischen Prozesse nicht zu groß sein. Als ein wesentlicher Bestandteil der molekularen Bildgebung können Kontrastmittel zum Verständnis molekularer Prozesse und zur Entwicklung maßgeschneiderter Diagnostika und Therapeutika beitragen. An der PTB werden seit mehr als 15 Jahren optische bildgebende Systeme entwickelt und zum Nachweis der Fluoreszenz in Gewebephantomen, Kleintiermodellen und zur Lokalisation von Tumoren und ihren Vorstufen sowie zum frühen Nachweis entzündlicher Prozesse im klinischen Bereich eingesetzt. 

Quantifizierung biomolekularer Bindungen mit magnetischen Nanopartikeln als Sonden

D. Eberbeck, U. Steinhoff, L. Trahms

In der Labormedizin, in der Lebensmittelüberwachung und bei der Entwicklung neuer Arzneistoffe spielen hochsensitive molekularbiologische Nachweisverfahren heute eine herausragende Rolle. So ist zum Beispiel der Nachweis bestimmter Enzyme oder Proteine, so genannter Biomarker, im Blut eines Patienten eine wichtige Methode zur Erkennung einer Krebserkrankung oder eines Herzinfarkts. Neben der Primärdiagnostik werden biomolekulare Nachweisverfahren zunehmend auch bei der Steuerung und Überwachung therapeutischer Verfahren eingesetzt.

Xenon als spezifische Sonde für die Magnetresonanztomographie

Wolfgang Kilian, Frank Seifert, Bernd Ittermann

Seit vielen Jahren ist die Protonen-Magnetresonanztomographie (1H-MRT) ein wichtiger Bestandteil in der bildgebenden Diagnostik. Als Signalquelle dient dabei das magnetische Moment des Protons im Wasserstoffatom. Diese Protonen-Magnetresonanz (1H-MR) ist eine Messmethode mit intrinsisch sehr geringen Signalstärken. Eine ortsaufgelöste Darstellung von Körperteilen, also eine Tomographie, ist nur aufgrund der hohen Zahl von Wasserstoffatomen im Wasser möglich, aus welchem Weichteilgewebe überwiegend besteht. Weltweit werden Forschungsarbeiten in großer Zahl durchgeführt, um die Empfindlichkeit und Aussagekraft der MRT zu steigern. Besonders intensiv wird die Verwendung von Kontrastmitteln zur Beeinflussung der 1H-MR Signale untersucht. In den letzten Jahren wurden derartige Kontrastmittel auch an spezifisch bindende Moleküle oder an Zellen gebunden und ihre spezifische Anreicherung im Körper mittels MRT dargestellt. Eine weitere Möglichkeit, um auf molekularer Ebene Aussagen mittels MR-Messungen gewinnen zu können, stellt die MR-Spektroskopie (MRS) dar. Hier wird nicht nur die lokale Verteilung der Signalstärken gemessen, sondern auch deren spektrale Verteilung. Je nach chemischer Umgebung der Wasserstoffatome ändert sich die Resonanzfrequenz des Kernspinsignals (chemische Verschiebung), so dass man nicht nur die Gewebearten unterscheiden, sondern auch den biologischen Zustand charakterisieren kann. Hier ist die Untersuchung von Stoffwechselprodukten (Metaboliten) im Gehirn ein bedeutendes Forschungsgebiet. Die MRS kann nicht nur rein qualitativ durchgeführt werden, sondern erlaubt es mit Hilfe von Referenzmessungen und mathematischen Analysen, auch quantitativ die molaren Metabolitkonzentrationen zu bestimmen.