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Validierung eines neuen Verfahrens zur DNA-Isolation für quantitative PCR-Anwendungen

01.06.2010

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine Methode, um spezifische DNA-Sequenzen in vitro zu vervielfältigen. Mit ihr lassen sich kleinste Mengen an DNA in kurzer Zeit millionenfach kopieren, so dass man sie mit den üblichen Labormethoden nachweisen, untersuchen und weiterverwenden kann. Theoretisch ist dafür ein einziges DNA-Molekül ausreichend, wodurch die PCR eine der empfindlichsten Nachweismethoden überhaupt darstellt.

Das Prinzip der PCR beruht auf immer wiederkehrenden thermischen Zyklen, die eine enzymatische Replikation der DNA beinhalten und somit eine exponentielle Vervielfältigung („Kettenreaktion“) ermöglichen. Im Vergleich zum bloßen Nachweis von DNA (qualitative PCR) erlaubt die quantitative oder real-time PCR die Anzahl gebildeter DNA-Moleküle bereits während des Amplifikationsprozesses zu erfassen. Zur Detektion der Produkte kommen unspezifische Fluoreszenzfarbstoffe, die sich in die doppelsträngige DNA einlagern, oder sequenzspezifische DNA-Sonden, die mit Fluoreszenzreportern markiert sind, zum Einsatz.

Vor der Amplifikation mittels PCR muss die DNA aus dem jeweiligen biologischen Probenmaterial isoliert und aufgereinigt werden. Die klassische Methode der DNA-Isolation ist zeit- und arbeitsintensiv und durch eine Vielzahl von Extraktions- und Zentrifugationsschritten gekennzeichnet.

Ziel eines gemeinsam von der Dr. Lerche KG und der PTB durchgeführten Technologie-Transfer-Projektes ist der Nachweis, dass Spezifität und Empfindlichkeit von Polymerase-Ketten­reaktio­nen durch ein innovatives Verfahren zur Isolation und Aufreini­gung von DNA aus humanem Blut wesentlich gesteigert werden können. Dieses Aufreinigungsverfahren beruht auf einem ausschlusschromatographischen Trennprinzip mit neuartigen porösen Trägermaterialien. Störende Verunreinigungen bisheriger DNA-Isoaltionsmethoden werden eliminiert und Beeinträchtigungen der Spezifität der PCR durch Kreuzreaktivitäten vermieden. Empfindlichkeit und Spezifität des neuen Verfahrens im Vergleich zu bisher übli­chen Präparationen sollen erstmals quantitativ mit der real-time PCR bestimmt werden. Die Validierung der innovativen Technologie erfolgt über die Quantifizierung der Wiederfindungsrate einer definierten Anzahl an DNA-Kopien unter Verwendung der in der PTB entwickelten Referenzverfahren zur durchflusszytometrischen Konzentrations­bestimmung von Zellen und der Zellsortierung.