Rückführung photometrischer Absorptionsmessungen zur genauen Bestimmung der Gesamt-Hämoglobinkonzentration im Blut

Einer der am häufigsten gemessenen Analyte in der Laboratoriumsmedizin ist die Gesamt-Hämoglobinkonzentration (Hb) im Blut. Grundlage ist die Umwandlung der verschiedenen Hämoglobin-Varianten durch geeignete Konversionsreagenzien in stabile Endprodukte, deren spektrales Absorptionsmaß anschließend mit einem Spektralphotometer bestimmt wird. Für die Bestimmung von Referenzwerten werden in der PTB zwei Verfahren eingesetzt, die Konversion der Hämoglobin-Varianten in Cyan-Hämiglobin (HiCN-Methode) und die Umwandlung der Hämoglobin-Varianten in einen Komplex aus alkalischem Hämatin und nicht-ionischem Detergenz (AHD-Komplex).

Die Gesamt-Hämoglobin- Konzentration im Blut wird bei beiden Methoden bestimmt durch die anschließende Messung des spektralen Absorptionsmaßes der Reaktionsprodukte bei den Wellenlängen λ = 540 nm (HiCN) und λ = 574 nm (AHD). Diese Wellenlängen liegen im Maximum der jeweiligen Q-Bande (siehe Abbildung 1).

Abbildung 1: Absorptionsspektren von HiCN und AHD. Die Wellenlängen von 540 nm und 574 nm, die zur Bestimmung der Gesamt-Hb-Konzentration verwendet werden, sind als vertikale Linien eingezeichnet.

Um eine Rückführung der photometrischen Absorptionswerte, aus denen die Konzentration des Gesamt-Hb bestimmt wird, zu erreichen, wurde die Kennlinie des für die Hb-Bestimmung verwendeten Spektralphotometers vermessen. Die Kennlinie ergibt sich aus dem Vergleich der Absorptionswerte von Graufiltern mit den mit dem nationalen Referenzinstrument in der PTB in Braunschweig (AG 4.24) gemessenen Referenzwerten des spektralen Absorptionsmaßes.

In Abbildung 2 sind Absorptionsspektren gezeigt, die man für die HiCN Methode (Abb. 2a) und die AHD-Methode (Abb. 2b) erhält. Dargestellt ist der vereinbarte Wert A des spektralen Absorptionsmaßes als Funktion der Wellenlänge. Die Messungen zur Rückführung zeigen, dass die Absorptionswerte der Filter sehr gut mit den Referenzwerten übereinstimmen, d.h. es werden nur Abweichungen < 10^-3 zwischen dem gemessenen spektralen Absorptionsmaß a und dem vereinbarten spektralen Absorptionsmaß A beobachtet. Dieser Sachverhalt ist in Abb. 2c und Abb. 2d dargestellt. Die Messunsicherheiten der Größe A ist allerding um mehr als eine Größenordnung größer als die Wiederholgenauigkeit der Messwerte a (siehe Abb. 2e und 2f), so dass die Messunsicherheiten der für die Rückführung verwendeten Filter einen erheblichen Beitrag zur kombinierten Messunsicherheit bei der Hämoglobinbestimmung liefern. Daraus ergibt sich, dass die Zuweisung von Referenzmesswerten für das Absorptionsmaß der Graufilter mit geringeren Messunsicherheiten sich auch in geringeren Messunsicherheiten bei der Gesamt-Hb-Messung auswirken würde.

Die mit den beiden Konversionsverfahren bestimmten Hämoglobinkonzentrationen stimmen sehr gut überein und belegen, dass beide Methoden sich als Methoden höherer Ordnung zur Bestimmung von Referenzwerten eignen.

Abbildung 2: Absorptionsspektren verdünnter Blutproben nach Konversion in HiCN (a) und AHD (b). Differenzen zwischen gemessenem Absorptionsmaß und vereinbartem Wert des Absorptionsmaßes für HiCN (c) und AHD (d). Erweiterte Messunsicherheiten ku(A) und ku(a) der vereinbarten Werte A und der Messwerte a für die beiden Konversionsverfahren HiCN (e) und AHD (f).

Witt K, Wolf HU, Kammel M, Kummrow A, Neukammer J (2013): Establishing traceability of photometric absorbance values for accurate measurement of the haemoglobin concentration in blood; Metrologia 50: 539-548

http://iopscience.iop.org/0026-1394/50/5/539/article

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