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Optisches Verfahren zur Quantifizierung großer Biomoleküle validiert: Messung des Gesamthämoglobin-Gehaltes mittels Isotopenverdünnungs-Ramanspektrometrie

31.10.2015

Die Konzentration von Hämoglobin (Hb) in biologischen Proben wie Vollblut ist ein wichtiger Pararmeter, um den Gesundheitszustand eines  Menschen berurteilen zu können. Daher hat die Bundesärztekammer (BÄK) diesen relevanten Marker in seine „Richtline zur Qualitätssicherung laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen“ aufgenommen und dazugehörige Messbereiche definiert. Jedoch zeigen regelmäßige Ringversuche des Referenzinstituts für Bioanalytik, an denen klinischen Laboratorien verpflichtet sind teilzunehmen, dass die Abweichungen der einzelnen Teilnehmer mitunter bei über 20 % im Vergleich zum Zielwert liegen. Erlaubt sind jedoch für Hb nur 6 %. Desweiteren fordert die BÄK Rückführung der Messmethoden auf das internationale Einheitensystem (SI).

 

 

 

 

 

 

Bändermodell des Hämoglobins, bestehend aus je zwei α-Ketten (rot, 141 Aminosäuren) und zwei β-Ketten (blau, 146 Aminosäuren) sowie vier eisenhaltigen farbgebenden Hämgruppen (Quelle: Opens external link in new windowwww.rcsb.org)

Eine Möglichkeit, genaue und rückführbare Messmethoden zu realisieren, besteht in der Anwendung der sog. Isotopenverdünnung (Isotope Dilution, ID). Dabei wird als interner Standard (Spike) der Blutprobe ein rekombinantes, mit Ausnahme des Hämins, vollständig 15N-markiertes Hb zugesetzt. Dieser Ansatz findet hauptsächlich in der Massenspektrometrie Anwendung, wurde in den vergangenen Jahren nach einem in der PTB entwickelten Verfahren auch in Kombination mit der Ramanspektrometrie zur Quantifizierung kleiner diagnostischer Marker in Serum (Kreatinin, Harnsäure) eingesetzt. Mit der Bestimmung des Gesamt-Hb in Blut ist nun erstmals auch die Konzentration eines biologischen Makromoleküls mittels ID-Ramanspektrometrie gemessen worden.Durch die Zugabe des Spikes resultiert eine Verschiebung einzelner Hb-spezifischer Banden im Ramanspektrum, so dass durch einen Vergleich der Bandenintensitäten von 15N-markierten und natürlichem Hb die Konzentration des im Blut enthaltenen natürlichen Hb bestimmt werden kann. Im Rahmen des EMRP-Projekts „Metallomics“ wurde unter Beteiligung von PTB (AG 3.14, AG 3.15, AG 8.32) und LNE diese Methode mit drei neu entwickelten massenspektrometrischen ID-Methoden sowie zwei annerkannten, aber nicht SI-rückgeführten spektrophotometrischen Referenzmethoden verglichen. Als Vergleichsprobe diente ein mit der HiCN-Methode zertifiziertes Referenzmaterial (JCCRM-912-2M).

 

aResultat einer Vergleichsmessung zur Bestimmung der Hämoglobinkonzentration im Referenzmaterial JCCRM-912-2M. Die roten Linien kennzeichnen den Median aller verwendeten Methoden sowie die zugehörige erweiterte Messunsicherheit.

Hiermit konnte gezeigt werden, dass sich die ID-Ramansspektrometrie und auch die anderen ID-Methoden sehr gut eignen, um die geforderte Rückführung der spektrophotometrischen Routineverfahren auf das SI zu realisieren, z. B. durch externe Qualitätskontrollen.