Physikalisch-Technische Bundesanstalt

Neues statistisches Verfahren zur Analyse von Sandwich ELISAs

 

Immunassays sind biochemische Tests, die die hohe Spezifität von Antikörper–Antigen–Bindungen ausnutzen und damit zur Bestimmung kleinster Stoffkonzentrationen in komplexen Medien eingesetzt werden können. Diese Tests werden vielseitig angewendet, z.B. um Infektionen, Hormone oder Drogen nachzuweisen. Ein solcher Immunassay ist der sogenannte Sandwich-ELISA, ein enzymgekoppelter Immunadsorptionstest, der den Nachweis von Antigenen durch deren Bindung an zwei Antikörper ermöglicht. Dabei wird ein Antikörper an ein Enzym gekoppelt, um ein nachweisbares Signal (wie z.B. Fluoreszenz, siehe Abbildung 1) zu generieren. Ein bekanntes Beispiel hierfür ist der häusliche Schwangerschaftstest.

 

Abbildung 1: ELISA Mikrotiterplatte

Quelle: [Voigt et al., 2008, Fig. 1]

 

Bei Fluoreszenz Sandwich-ELISAs wird die Konzentration einer Lösung aus einer Reihe von Fluoreszenzmessungen geschätzt, die durch wiederholtes Verdünnen und chemische Behandlung der Originallösung generiert werden. Um die Beziehung zwischen Konzentration und Fluoreszenzmessung besser bestimmen zu können, wird für jedes ELISA ebenfalls eine Kalibration durchgeführt. D.h. dieselben Protokollschritte werden mit einer Lösung bekannter Konzentration durchgeführt. Dies ist in Abbildung 2 illustriert.

Abbildung 2: Darstellung des Aufbaus eines typischen ELISAs, bestehend aus Intensitätsmessungen bekannter

Konzentrationen (mit denen die Kalibration durchgeführt wird) und Intensitätsmessungen unbekannter Konzentrationen.

 

Diese Beziehung zwischen Konzentration und Fluoreszenzintensität kann mithilfe eines statistischen Modells beschrieben werden (durch ein nichtlineares Modell mit variablem Gauß‘schen Fehlerterm). Die Abschätzung dieses Modells (Kalibration) und dessen Anwendung für die Bestimmung der unbekannten Konzentration ist statistisch eine anspruchsvolle Aufgabe, wie eine aktuelle internationale Vergleichsstudie [Noble et al., 2008] anhand des Proteins IFN alfa-2b verdeutlicht. In dieser Studie schätzten einige Labore durchschnittliche Konzentrationen, die doppelt so hoch waren wie die anderer Labore. Die angegebenen Messunsicherheiten dieser Konzentrationsschätzungen decken diese gravierenden Unterschiede bei weitem nicht ab.

An der PTB wurde ein neues statistisches Verfahren zur Analyse von ELISAs entwickelt. Dieses Verfahren nutzt den Bayesschen Ansatz und kombiniert somit in kohärenter Weise die Kalibration des Modells und die Bestimmung der unbekannten Stoffkonzentration. Dies führt zu vertrauenswürdigen Unsicherheitsintervallen für Schätzwerte. Darüber hinaus ermöglicht der Bayessche Ansatz die Berücksichtigung von Vorwissen (durch Formalisierung als Wahrscheinlichkeitsverteilung) und die unabhängige Analyse jedes einzelnen Datensatzes.

Das entwickelte statistische Verfahren ist allgemein anwendbar zur Konzentrationsschätzung durch ELISAs. Als Fallstudie wurden die Messdaten der oben erwähnten internationalen Vergleichsstudie erneut ausgewertet. Im Ergebnis wurden korrigierte Konzentrationswerte und realistischere Messunsicherheiten erzielt, und im Gegensatz zur ursprünglich vorgeschlagenen Datenanalyse konnte eine weitgehende Konsistenz der experimentellen Methoden verifiziert werden [Klauenberg et al., 2011]. Mit dem neuen statistischen Auswerteverfahren ist es nun möglich, die Messdaten von Fluoreszenz ELISAs zuverlässig zu evaluieren, und damit auch die Konzentration von Interferon IFN alfa-2b verlässlich zu bestimmen.

 

Literatur

• [Noble et al., 2008] J. E. Noble, L. Wang, E. Cerasoli, A. E. Knight, R. A. Porter, E. Gray, C. Howe, E. Hannes, P. Corbisier, J. Wang, L. Wu, et al. (2008). An international comparability study to determine the sources of uncertainty associated with a non-competitive sandwich fluorescent ELISA. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 46, 7, 1033–1045.
• [Voigt et al., 2008] J. Voigt, B. Ebert, A. Hoffman und R. Macdonald (2008). Validierung eines ’Fluorescent Enzyme Linked Immuno Sandwich Assay’ (ELISA). PTB-Mitteilungen, 118, 4, 255–260.
• [Klauenberg et al., 2011] K. Klauenberg, B. Ebert,  J. Voigt, M. Walzel, J.E. Noble, A.E. Knight, and C. Elster (2011). Bayesian analysis of an international ELISA comparability study. Chemistry and Laboratory Medicine, in press.

 

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