Einleitung
Immunassays sind biochemische Tests, in denen die hohe Spezifität von Antikörper–Antigen–Bindungen ausgenutzt wird, um auch sehr kleine Stoffmengen messen zu können. Immunassays werden vielseitig angewendet, z.B. um Infektionen, Hormone oder Drogen nachzuweisen.
Im Fokus dieser Arbeit steht ein enzymgekoppelter Immunadsorptionstest, der Sandwich-ELISA genannt wird. Dieser ermöglicht den Nachweis von Antigenen, indem diese zwischen zwei Antikörpern gebunden werden. Ein Antikörper wird dabei mit einem Enzym gekennzeichnet, um ein nachweisbares Signal (wie z.B. Fluoreszenz, siehe Abbildung 1) zu generieren.
Während ein bekanntes Beispiel der häusliche Schwangerschaftstest ist, sind wir daran interessiert, mithilfe eines Fluoreszenz Sandwich-ELISA die Konzentration des menschlichen Interferon IFN alfa-2b zu bestimmen (ein Protein, welches bei der angeborenen Immunabwehr gegen Virusinfektionen involviert ist). Wir entwickeln eine Methode zur Schätzung von Konzentrationen und dazugehörigen Unsicherheiten. Diese Methode ist allgemein anwendbar oder anpassbar, unabhängig vom spezifischen ELISA.
Abb. 1: ELISA Mikrotiterplatte
Quelle: [Voigt et al., 2008, Fig. 1]
Ziel der Studie
Bei Fluoreszenz Sandwich-ELISAs wird die Konzentration einer Lösung aus einer Reihe von Fluoreszenzmessungen geschätzt, die durch wiederholtes verdünnen und chemische Behandlung der Originallösung generiert werden. Um die Beziehung zwischen Konzentration und Fluoreszenzmessung besser bestimmen zu können, wird für jede ELISA-Platte ebenfalls eine Kalibration durchgeführt. D.h. dieselben Protokollschritte werden mit einer Lösung bekannter Konzentration durchgeführt. Dies ist in Abbildung 2 illustriert.
Abb. 2: Darstellung des Aufbaus eines typischen ELISAs, bestehend aus Intensitätsmessungen bekannter Konzentrationen, mit denen die Kalibration durchgeführt wird, und Intensitätsmessungen unbekannter Konzentrationen.
Typischerweise umfassen ELISAs eine Vielzahl von z.T. fehleranfälligen Reaktionsschritten. Eine aktuelle Publikation [Noble et al., 2008] hebt dazu die Variabilität von ELISA-Konzentrationsschätzungen im Rahmen einer internationalen Vergleichsstudie hervor. Einige Labore schätzen durchschnittliche Konzentrationen die doppelt so hoch sind, wie die anderer Labore. Die oben genannte Publikation nimmt jedoch wenig Bezug auf Unsicherheiten einzelner ELISA-Schätzwerte.
Wir reanalysieren die Daten, um die Unsicherheiten einzelner Laborschätzwerte zu quantifizieren. Dies ermöglicht dann die Beurteilung der Konsistenz von Konzentrationsschätzungen verschiedener Labore untereinander und miteinander, und wird diesbezügliche Ringvergleiche in der Metrologie unterstützen [BIPM, 1999].
MODEL SET-UP
Angenommen, alle Paare aus Fluoreszenzintensitäten und Konzentrationen (Y, X) folgen einem heteroskedastischen nichtlinearen Gaußschen Modell
(1)
Dabei sei ƒ die sigmoide Funktion, die in Abbildung 3 dargestellt ist, und εi ~ N(0, a·Xi + c) sei das Fehlermodell.
Um die unbekannte Konzentration 
zu schätzen, wenden wir Bayes’ Theorem zweimal an.
Für die Kalibration:
Für die Schätzung:
Um den Bayesschen Ansatz anzuwenden, muss a priori das Wissen zu allen unbekannten Größen quantifiziert werden. Wir verwenden nichtnegative Gleichverteilungen als Prior für alle Parameter a, c, ß, X, außer für die obere Asymptote ß1. Kontrollproben (aus Fluorescein), die auf jeder ELISA-Platte durchgeführt werden, liefern Informationen über die maximale Intensität (das maximale ß1), die ungefähr das hundertfache der Intensität der Kontrollkavitäten beträgt. Wir spezifizieren deshalb eine Gleichverteilung als Prior für ß1, wobei die obere Schranke durch die Intensitätsmessungen der Kontrollkavitäten begrenzt ist. Ein Beispiel dieses Prior ist in Abbildung 4 dargestellt.
Abb. 3: Typische sigmoide Kalibrations-
funktionen f hergeleitet aus Kalibrationsdaten der PTB
Abb. 4: Ein typisches Beispiel einer a-priori-Verteilung für die obere Asymptote ß1 der sigmoiden Kalibrationsfunktion f, die aus den drei Fluorescein-Kontrollproben abgeleitet wurde.
Ergebnisse
Kalibrationsschritt
Der oben beschriebene Ansatz bestehend aus Bayesscher Kalibration und Bayesscher Konzentrationsschätzung wird zurzeit auf sämtliche Daten der oben erwähnten internationalen Vergleichsstudie angewandt. Erste Ergebnisse lassen auf deutlich größere Unsicherheiten schließen, als sie für ELISA-Tests bisher (in Noble et al., 2008) angegeben wurden.
Abb. 5: Für einen ELISA, der an der PTB durchgeführt wurde, stellen die grauen Flächen typische a-posterior-Verteilungen dar, die geschätzt wurden für die zwei Parameter a, c des Fehlermodells (A) und die vier Parameter ß der Kalibrationsfunktion f (B) . Die a-priori-Verteilungen, die angenommen wurden, sind durch schwarze Linien abgebildet.
Konzentrationsschätzung
Der oben beschriebene Ansatz bestehend aus Bayesscher Kalibration und Bayesscher Konzentrationsschätzung wird zurzeit auf sämtliche Daten der oben erwähnten internationalen Vergleichsstudie angewandt. Erste Ergebnisse lassen auf deutlich größere Unsicherheiten schließen, als sie für ELISA-Tests bisher (in Noble et al., 2008) angegeben wurden.
Abb. 6: Wird das Modell (1) im Rahmen des Bayesschen Ansatzes auf die Intensitätsmessungen der unbekannten Konzentration der PTB angewendet (unter Annahme der Verteilung der Kalibrationsparameter, die in Abbildung 5 dargestellt sind), ergeben sich die abgebildeten a-posteriori-Verteilung (in grau dargestellt) und der Schätzwert (in schwarz) der unbekannten Konzentration. Analoge Ergebnisse werden für alle Teilnehmer der internationalen Vergleichsstudie erwartet.
Vorteile
Bayessche Statistik bietet verschiedene Vorteile für ELISA Konzentrationsschätzungen. Sie:
- erbringt vertrauenswürdige Unsicherheitsintervalle.
- erlaubt die kohärente Kalibration und Konzentrationsschätzung für ELISA-Messungen.
- ermöglicht die unabhängige Analyse jedes Datensatzes.
- ergibt konsistente Konzentrationsschätzungen für die PTB-Messungen.
Gegenüber traditionellen frequentistischen Ansätzen sowie metrologischen Standards, bietet Bayessche Statistik die Möglichkeit a priori Wissen einzubinden und führt trotz der nichtlinearen Kalibrationskurve und unbekannten Parametern im Fehlermodell zu adequaten Unsicherheiten.
Literatur
- K. Klauenberg, B. Ebert, J. Voigt, M. Walzel, J. E. Noble, A. E. Knight and C. Elster (2011). Bayesian analysis of an international ELISA comparability study. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. ISSN (Online) 1437-4331, ISSN (Print) 1434-6621, doi: 10.1515/CCLM.2011.648. [
download pdf (1183kB) ]
- [Voigt et al., 2008] J. Voigt, B. Ebert, A. Hoffman and R. Macdonald (2008). Validierung eines ’Fluorescent Enzyme Linked Immuno Sandwich Assay’ (ELISA). PTB-Mitteilungen, 118 , 4, 255–260.
- [BIPM, 1999] Bureau International des Poids et Mesures (1999). Mutual Recognition of National Measurement Standards and of Calibration and Measurement Certificates issued by National Metrology Institutes.
- [Lunn et al., 2000] D. J. Lunn, A. Thomas, N. Best and D. Spiegelhalter (2000). WinBUGs – A Bayesian modelling framework: Concepts, structure, and extensibility. Statistics and Computing, 10, 4, 325–337.
- [Noble et al., 2008] J. E. Noble, L. Wang, E. Cerasoli, A. E. Knight, R. A. Porter, E. Gray, C. Howe, E. Hannes, P. Corbisier, J. Wang, L. Wu, et al. (2008). An international comparability study to determine the sources of uncertainty associated with a non-competitive sandwich fluorescent ELISA. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 46, 7, 1033–1045.
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