In Kooperation mit dem Robert-Koch-Institut Berlin wurden Gewebeschnitte humaner Tonsillen untersucht. Abbildung 2 zeigt die mit dem konfokalen Mikroskop gemessene Intensitätsverteilung der Fluoreszenz. Aktivierte T-Zellen wurden mit Anti-ICOS-Dig Antikörpern markiert, die wiederum einen fluoreszenzmarkierten Antikörper (Anti-Dig-Cy5) tragen. Man erhält Schnittbilder der Zelle, da die axiale Unschärfe im vorliegenden Falle mit 0,9 µm weit geringer als die Zellgröße ist (ca. 10 µm). Im Bild erscheint der Zellkern als relativ dunkles Objekt, welches von der hell leuchtenden, mit farbstoffmarkierten Antikörpern belegten Zellmembran umschlossen ist. Dargestellt ist die detektierte Photonenzählrate in einer Falschfarbenskalierung. Durch gesonderte Messungen wurden die Farbstoffbelegung der Antikörper sowie die molekulare Helligkeit der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffmoleküle ermittelt. So lässt sich letztlich die Anzahldichte gebundener Antikörper aus den Fluoreszenzintensitäten abschätzen. Im vorliegenden Beispiel wurde eine Belegungsdichte von ca. 20 Antikörpern pro µm² Zelloberfläche geschätzt. Anhand der Antikörperbindungskapazität können Zellen über ihre Typisierung hinaus auch hinsichtlich ihres biologischen Funktionszustandes beurteilt werden. 

Förster Resonanz Energie Transfer (FRET) ist der Energieübertrag von einem optisch angeregten Donorfluorophor auf ein in der Nähe befindliches Akzektormolekül. Hier werden nur Akzeptormoleküle betrachtet, die hohe Fluoreszenzausbeute zeigen. Der Energieübertrag erfolgt strahlungslos durch Dipol-Dipol Wechselwirkung zwischen Donor- und Akzeptormolekül und zeigt eine starke Abstandsabhängigkeit. Der relative Anteil von Donor- zu Akzeptor-Fluoreszensintensität lässt sich somit zur Messung ihres Abstandes ausnutzen. Quantitatvie Abstandsmessungen werden jedoch im Wesentlichen durch zwei praktische Probleme erschwert.

In Zusammenarbeit mit der Fa. PicoQuant GmbH wurde an der PTB ein Verfahren entwickelt, bei dem unvollständig markierte Moleküle erkannt und von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden können und welches außerdem die Quantifizierung der experimentellen Bedingungen ermöglicht. Quantitative Abstandsmessungen im nm-Bereich werden so mööglich.
Abbildung 3 zeigt das Prinzip einer PIE-FRET Messung an Molekülen in Lösung. Während das Molekül durch das konfokale Volumen diffundiert, wird es abwechselnd mit zwei Laserpulsen angeregt (Pulsed Interleaved Excitation − FRET, Pulsabstand 12,5 ns). Dabei hat der erste Laserpuls eine Wellenlänge, die geeignet ist, das Donorfluorophor anzuregen. Entsprechend werden nach dem ersten Laserpuls Fluoreszenzphotonen des Donors oder aber durch Energietransfer vermittelte Fluoreszenzphotonen des Akzeptors detektiert. Der zweite Laserpuls dient der direkten Anregung des Akzeptors. So kann unabhängig vom FRET Prozess festgestellt werden, ob das im konfokalen Volumen befindliche Molekül über einen fluoreszierenden Akzeptor verfügt.
Die Photonenzählrate ist in Abb. 3 als Funktion der Zeit aufgetragen. Das Signal besteht zum größten Teil aus Untergrundrauschen. Da bei diesem Verfahren mit sehr geringen Konzentrationen gearbeitet wird befindet sich die meiste Zeit kein Molekül im Detektionsvolumen . Um nun Einzelmolekülereignisse herauszufiltern, wird ein Schwellwertverfahren eingesetzt, bei dem nur Ereignisse den Filter passieren, welche eine bestimmte Signalintensität im Akzeptorkanal nach direkter Anregung des Akzeptors aufweisen. So wird gleichzeitig sichergestellt, dass nur Moleküle mit intaktem Akzeptorfluorophor in der weiteren Analyse berücksichtigt werden. Aus den isolierten Einzelmolekülereignissen wird dann ein Histogramm errechnet, welches die Abstandsverteilung der Probe beschreibt. 

Zum Vergleich enthält Abbildung 4 verschiedene theoretische Modelle zur Beschreibung der Abstandsabhängigkeit des Energietransfers von der Konturlänge der Polyprolin-Moleküle. Die gestrichelte blaue Linie stellt die einfache Abhängigkeit nach Förster dar, die sich für starre Polyproline-Moleküle ergibt, während die gepunktete schwarze Linie die molekulare Dynamik der Polyprolin-Moleküle berücksichtigt. Sie beschreibt gut die Lebensdauermessungen. Die rote Kurve berücksichtigt zusätzlich noch die erwähnten unterschiedlichen Anregungs- und Nachweiseffizienzen sowie das spektrale Übersprechen der Detektionskanäle. Offensichtlich sind diese experimentellen Parameter bei der Analyse von scheinbaren Energietransfereffizienzen unverzichtbar. 

Die Fluoreszenz Korrelations-Spektroskopie (FCS) ist ein weit verbreitetes Einzelmolekül-Messverfahren zur Bestimmung niedrigste Konzentrationen (bis 10^-12 mol/L) sowie zur Analyse der Diffusion einzelner oder weniger Moleküle. Grundlage sind die Korrelationseigenschaften der Photonenzählrate (s. Abb. 3). FCS wird oft als ein Hilfsmittel zur absoluten Messung von Konzentrationen und Diffusionskoeffizienten diskutiert. Aus einer FCS Messung lässt sich aber nur die mittlere Anzahl der Moleküle im Detektionsvolumen bestimmen sowie die Diffusionszeit, die diese Moleküle zur Durchquerung des Detektionsvolumens benötigt haben,. Zusätzlich Angaben über das Detektionsvolumen sind bei Anwendung der konfokalen Mikroskopie nötig, um daraus Konzentrationen oder Diffusionskoeffizienten ermitteln zu können.
In Zusammenarbeit mit der Fa. PicoQuant GmbH wurden drei verschiedene Verfahren zur Ermittlung des konfokalen Volumens in Bezug auf Ihre Genauigkeit untersucht. Als erstes wurde das konfokale Volumen mittels einer FCS Messung an Farbstofflösungen bekannter Konzentration kalibriert (siehe Abb. 5). Die erzielte relative erweiterte Messunsicherheit beträgt im gezeigten Beispiel 20% (Erweiterungsfaktor 2) bei einem konfokalen Volumen von 1,0 fL und wurde im Wesentlichen durch die Genauigkeit der Verdünnung einer Stammlösung mittels Pipettieren begrenzt. Hier sind prinzipiell noch Verbesserungen möglich; das Verfahren ist aber sehr zeitaufwändig und kann oft nicht unter den gleichen Bedingungen wie die eigentliche Messaufgabe durchgeführt werden.