Bei Malaria Patienten treten weiße Blutzellen auf, die das Malaria-Pigment Hämozoin aufgenommen haben. In der PTB wurden in Zusammenarbeit mit der Charité, Klinik für Infektiologie, die Konzentrationen derartig veränderter weißer Blutzellen (Pigment-tragende Monozyten) mit hoher Nachweisempfindlichkeit durchflusszytometrisch bestimmt und signifikante Unterschiede zwischen nicht-immunen und semi-immunen Patienten festgestellt1.
Das in der PTB erprobte durchflusszytometrische Verfahren erlaubt einen Malaria-Nachweis mit einer Spezifität von 100 % für semi-immune Patienten und 86 % für nicht-immune Patienten, eine Sensitivität von 100 % wurde für beide Patientenkollektive erreicht.
Die Malaria ist eine der gefährlichsten Infektionskrankheiten weltweit mit ca. 2,5 Millionen Todesfällen pro Jahr. Auch in Industrienationen kommt es zu Todesfällen, die durch eine möglichst frühe Erkennung der Infektion verhindert werden könnten.
Als Standardverfahren zur Malaria-Diagnostik gilt die Mikroskopie, die die Unterscheidung der vier verschiedenen Parasitenarten (Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale) sowie die Bestimmung der Konzentration der von Parasiten befallenen roten Blutzellen erlaubt. Derartige Untersuchungen werden jedoch nur bei einem klinischen Verdacht durchgeführt, so dass es zum Beispiel bei Personen nach einer Reise in endemische Gebiete zu einer Verzögerung der Diagnosestellung kommen kann.
Der durchflusszytometrische Nachweis charakteristischer Änderungen im Blut von Malaria Patienten kann bei einem nicht eindeutigen klinischen Befund einen ausreichenden Verdacht auf eine Malaria Erkrankung begründen und so die mikroskopische Malaria Diagnostik einleiten.
Um die Eignung der Durchflusszytometrie als Screening-Verfahren zur Malaria Erkennung zu überprüfen, wurde die Konzentration von Monozyten mit Malaria-Pigment (PCM) gemessen. Nach Aufnahme des doppelbrechenden Malaria-Pigments Hämozoin, einem Abbauprodukt der Parasiten, zeichnen sich Monozyten durch eine große Intensität des depolarisierten seitlichen Streulichtes aus. In Bild 1 ist diese Messgröße für etwa

Bild 1: Streudiagramm der Blutprobe eines Malariapatienten
250000 Leukozyten gegen die Intensität des seitlichen Streulichtes ohne Polarisationsanalyse aufgetragen. Die Pigment-tragenden Monozyten erscheinen in diesem Streudiagram in der mit PCM bezeichneten Region. Die Identifikation der PCM erfolgte durch Sortierung dieser Zellen und nachfolgende mikroskopische Analyse. Ge bezeichnet die eosinophilen, Gn die

Bild 2: Hellfeldaufnahme eines Monozyten mit Malaria-Pigment. Rechts oben: Polarisationsmikroskopische Aufnahme des Hämozoin-Einschlusses
neutrophilen Granulozyten. Zur Messung der Lichtstreuung wurde Krypton-Ionen-Laserstrahlung mit einer Wellenlänge von 647,1 nm eingesetzt. Bild 2 zeigt die mikroskopische Hellfeldaufnahme eines aus der PCM Region sortierten Monozyten mit einem dunklem Hämozoin-Einschluss, der sich neben dem blau gefärbten Zellkern befindet. Die doppelbrechenden Eigenschaften des Hämozoin − Einschlusses werden in der polarisationsmikroskopischen Aufnahme im kleinen Ausschnitt der Abbildung deutlich.
Aus durchflusszytometrischen Streudiagrammen entsprechend Bild 1 wurde die Anzahl der in der PCM − Region beobachteten Ereignisse gezählt. Durch Vergleich mit der Gesamtanzahl aller beobachteten Zellen ergibt sich die relative Konzentration von Zellen in dieser Region bezogen auf die Konzentration aller Leukozyten. Relative Konzentrationen zwischen 10-6 und 10-2 wurden für die drei untersuchten Kollektive (Malaria negative Personen, nicht-immune und semi-immune Malaria Patienten) beobachtet. Das Ergebnis der Untersuchungen zeigt Abbildung 3, in der die normierte

Bild 3: Normierte kumulative Häufigkeit der Patienten als Funktion der relativen Konzentration Pigment-tragender Monozyten
kumulative Häufigkeit der Patienten als Funktion der relativen Konzentration der Zellen in der PCM − Region aufgetragen ist. Die als vertikale Linie eingezeichnete Schwelle von 3,3 x 10-5 entspricht dem biologischen Untergrund, d.h. auch bei Malaria-negativen Personen werden Ereignisse in der PCM − Region mit dieser Häufigkeit registriert. Die offenen Symbole kennzeichnen Malaria-negative Personen, geschlossene Kreise (Dreiecke) nicht-immune (semi-immune) Malaria Patienten. Bei nicht-immunen Patienten handelt es sich meist um Angehörige von Industrienationen, die von einer Reise zurückkehren, während semi-immune Patienten in Epidemiegebieten leben und wegen des andauernden Kontaktes mit den Parasiten eine Teilimmunität erworben haben. Aufgrund der Teilimmunität treten bei dieser Patientengruppe die charakteristischen Symptome einer Malaria Erkrankung erst bei einer höheren Konzentration der PCM (Abbildung 3) auf.
Krämer, B.; Grobusch, M.P.; Suttorp, N.; Neukammer, J.; Rinneberg, H.
Relative Frequency of malaria pigment-carrying monocytes of nonimmune and semi-immune patients from flow cytometric depolarized side scatter.
Cytometry 45 (2001), 133-140
Grobusch, M.P.; Hanscheid, T.; Krämer, B.; Neukammer, J.; May, J.; Seybold, J.; Kun, J.F.; Suttorp, N.
Sensitivity of hemozoin detection by automated flow cytometry in non- and semi-immune malaria patients.
Cytometry 55 (2003), 46-51
Prof. M.P. Grobusch, M.D.;
Infectious Diseases, University of the Witwatersrand, Johannesburg, South Africa
Medizinische Klinik (Infektiologie), Charité, Humboldt-Universität, Berlin
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