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Physikalisch-Technische Bundesanstalt

FachabteilungenAbt. 8 Medizinphysik und metrologische Informationstechnik 8.3 Biomedizinische Optik8.32 Durchflusszytometrie und Mikroskopie > Durchflusszytometrie zur Zellzählung und Zelldifferenzierung
Durchflusszytometrie und Mikroskopie
Arbeitsgruppe 8.32

Durchflusszytometrie zur Zellzählung und Zelldifferenzierung

Messverfahren und messtechnische Entwicklungen

Bei einem Durchflusszytometer treten die Blutzellen einer verdünnten Blutprobe einzeln nacheinander durch eine Wechselwirkungszone, in der bei der Impedanz-Zellzählung die Änderung der elektrischen Leitfähigkeit und bei der Laser-Durchflusszytometrie die Lichtstreuung und die Laser-induzierte Fluoreszenz gefärbter Zellen gemessen und zur ihrer Differenzierung ausgenutzt werden. In einem Hochgeschwindigkeits-Zellsortierer werden Zellen, die eine bestimmte Lichtstreuung oder ausgewählte Fluoreszenzeigenschaften aufweisen, durchflusszytometrisch sortiert, um anschließend weiter mikroskopisch untersucht werden zu können. 

In der PTB wurde ein auf der Laser-Durchflusszytomertrie basierendes Streulichtverfahren entwickelt, bei dem zur Zählung weißer Blutzellen die bisher notwendige Zerstörung  roter Blutzellen (Hämolyse) durch Reagenzien nicht mehr erforderlich ist1,2. Damit ist dieses Verfahren insbesondere zur Untersuchung pathologischer Blutproben geeignet, bei denen lyse-resistente roten Blutzellen oder gegenüber den Lyse - Reagenzien besonders empfindliche weißen Blutzellen  auftreten. Auch beim Nachweis von Tumor - Zellen im Blut bereitet diese Methode Vorteile, da auch Tumorzellen durch eine Hämolyse zerstört werden können.
Das durchflusszytometrische Streulichtverfahren basiert auf der starken Absorption des Hämoglobins der roten Blutzellen bei einer Wellenlänge von etwa 414 nm. Bei dieser Wellenlänge führt die Absorption zu einer drastisch reduzierten Lichtstreuung der roten Blutzellen, so dass weiße und rote Blutzellen sich in ihrer Lichtstreuung unterscheiden. Dies erlaubt es, die Konzentration roter und weißer Blutzellen simultan durch Lichtstreuung zu bestimmen.

Anwendungen

Im Fachlaboratorium 8.32 der PTB wird sowohl die Impedanz-Zellzählung als auch die Laser-Durchflusszytometrie zur Bestimmung von Referenzwerten für die Konzentration der roten Blutzellen (Erythrozyten) , der weißen Blutzellen (Leukozyten) und der Blutplättchen (Thrombozyten) bei Ringversuchen zum Kleinen Blutbild eingesetzt.

Die Laser-Durchflusszytomerie wird darüberhinaus zur weiteren Differenzierung weißer Blutzellen verwendet. Durch die Messung der Intensität des Streulichtes und der Depolarisation werden weiße Blutzellen in neutrophile Granulozyten, eosinophile Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten unterschieden. Die zusätzliche Färbung von Oberflächenstrukturen mit monoklonalen Antikörpern und der Nachweis der Laser-induzierten Fluoreszenz erlaubt die Bestimmung des Immunstatus eines Patienten, d.h. die Messung der relativen Konzentrationen von Lymphozytensubpopulationen. Zur Identifikation von Tumorzellen wird neben der Markierung von spezifischen Oberflächenstrukturen der Zelle die DNA angefärbt, da der DNA-Gehalt und der Zellteilungszyklus von normalen Zellen und Tumorzellen unterschiedlich sein kann. 

Die Zellsortierung erlaubt die Auswahl von Zellen mit definierten Streulicht- oder Fluoreszenzeigenschaften und die anschließende elektrostatische Sortierung z.B. auf einen Objektträger. Danach können sortierte Zellen mikroskopisch einer bestimmten Zellpopulation zugeordnet oder beispielsweise durch eine Malaria Erkrankung veränderte weiße Blutzellen identifiziert werden.

 

Veröffentlichungen

  1. Ost, V.; Neukammer, J.; Rinneberg, H.
    Flow Cytometric Differentiation of Erythrocytes and Leukocytes in Dilute Whole Blood by Light Scattering.
    Cytomerty 32 (1998), 191-197

  2. Ost, V; Rinneberg, H.;  Neukammer, J.
    Verfahren zur Differenzierung, Konzentrationsbestimmung und Sortierung von Erythrozyten, Thrombozyten und Leukozyten
    Patentschrift DE 4309328C2 (1998)

 

Ansprechpartner


© Physikalisch-Technische Bundesanstalt, letzte Änderung: 2011-11-17, Webmaster Abteilung 8 Seite drucken DruckansichtPDF-Export PDF