Einsatz von Fluoreszenz-gestützten Mess- und Bildgebungsverfahren zur quantitativen Untersuchung der Mechanismen der gentherapeutischen Blockade der Hämsynthese durch RNA-Interferenz zur Diagnose und Therapie von Tumorerkrankungen

 Häufig ist nicht der primäre Tumor, sondern sind dessen Metastasen die Ursache für den fatalen Ausgang vieler Karzinomerkrankungen. Die frühzeitige Diagnose und eine gezielte Therapie sind die Voraussetzung für eine erfolgreiche Behandlung. Trotz bedeutender Verbesserungen in der Diagnose und den adjuvanten Therapien sind die meisten Todesfälle bei Karzinomerkrankungen häufig auf Metastasen zurückzuführen, die gegen herkömmliche Therapien resistent sind. Durch den Einsatz einer gentherapeutischen Blockade der Hämsynthese durch RNA-Interferenz (siRNA-Technologie) lässt sich eine Minderexpression der Ferrochelatase (FECH) induzieren, die zum Anstieg der Protoporphyrin IX (PpIX) Fluoreszenz in Tumorgeweben führt. Die Entwicklung von Mess- und Bildgebungsverfahren zur Verbesserung des quantitativen Verständnisses dieser biomolekularen Vorgänge könnte den Zugang zu vollkommen neuen diagnostischen und therapeutischen Ansätzen bis hin zu strategischen Fragen der Grundlagenforschung bieten. Klinische Anwendungen der PpIX-Fluoreszenz reichen von einem verbesserten Nachweis von zirkulierenden Tumor-Zellen im Blut, zu einer besseren Definition von Tumorrändern in der Chirurgie, sowie Präkanzerosen und frühen Tumoren. Außerdem könnte die FECH-siRNA induzierte Bildung von Protoporphyrin-IX die Nachweisempfindlichkeit und damit die Sicherheit endoskopischer Diagnosen verbessern. Die gezielte Akkumulation von Protoporphyrin-IX wäre auch für therapeutische Anwendungen einsetzbar, um in Kombination mit einer Laserbehandlung die selektive Zerstörung von siRNA-transfizierten Tumorzellen zu erreichen.

 Die Registrierung von 2D-Projektionen der PpIX Fluoreszenz zur Tumorlokalisation ist wegen der Anregungswellenlänge und der abgestrahlten Fluoreszenzwellenlänge, die nicht im optischen Fenster für biologische Gewebe liegen eine schwierige messtechnische Aufgabe. Zum Nachweis der Fluoreszenz aus tiefer liegenden streuenden Schichten wird eine rauscharme hochempfindliche Nachweistechnik benötigt. Zur Vorbereitung des klinischen Einsatzes der „Genblockade Methode“ sind umfangreiche Untersuchungen am Tiermodell erforderlich. Dabei liegt der metrologische Aspekt in der Vergleichbarkeit der Messungen, sowohl intra-individuell zwischen verschiedenen Körperregionen als auch inter-individuell zur einheitlichen Bewertung der Anreicherung von PpIX in Tumoren. Die Vergleichbarkeit soll durch die Entwicklung und Untersuchung verschiedener Normierungsverfahren erzielt werden. Dabei stellt die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität durch den Bezug auf fluoreszierende Streukörper einen wesentlichen Aspekt zur Sicherstellung der Messgenauigkeit dar. Durch ihre bisherigen Forschungs- und Entwicklungsarbeiten auf dem Gebiet der molekularen Fluoreszenzbildgebung an Tumormodellen verfügt die PTB über ausgewiesene Fachkompetenz, die in die aktuellen Arbeiten eines von der Wilhelm Sander-Stiftung geförderten Projektes eingebracht wird.

    In kolorektalem Tumorgewebe kommt es zu einer spezifischen Anhäufung von Protoporphyrin-IX, einem Metaboliten der Hämsynthese (Moesta et al.). Häm und Hämproteine sind wichtige Komponenten fast aller Zellen des Organismus. Die Ursache der erhöhten Bildung von PpIX in Karzinomgewebe war bisher nicht bekannt. Daher haben wir in vorangegangenen Arbeiten die Aktivität verschiedener Enzyme der Hämsynthese bestimmt und die mRNA-Expression der Enzyme durch quantitative Real-time PCR untersucht (Kemmner et al.). Der starke Anstieg der PpIX-Fluoreszenz nach Zugabe von siRNA zur Suprimierung der FECH – Exprimierung ist in Abb. 1 demonstriert.

Abbildung 1: Mikroskopbilder von mit Aminolevulinsäure behandelten LS174 Zellen (a) und zusätzlich mit siRNA behandelten LS174 Zellen (c) nach Zwei-Photonenanregung. Die Fluoreszenzintensität der einzelnen Pixel ist im entsprechenden Streudiagramm (b und d) gezeigt. Das Streudiagramm stellt die PpIX-Fluoreszenz λ_em = 635 nm in Abhängigkeit von der Intensität der Autofluoreszenz λ_em = 535 nm dar. Die Behandlung der LS174T Zellen mit 50nM FECH-1140 siRNA führt zu einer starken Zunahme der PpIX-Fluoreszenz.

Die Übertragung dieser an isolierten Zellen in vitro gewonnenen Ergebnisse auf in vivo Systeme erfordert das Einschleusen der siRNA in Zellen eines Tiermodells. Dieser Schritt gelang durch die Einbettung der siRNA in Liposomen, was wir durch Bildgebungsex-perimente erstmals nachweisen konnten (s. Abb. 2).

Abbildung 2: In-vivo Fluoreszenz von xenotransplantierten humanen Kolonkarzinomen in Nacktmäusen. Die Fluoreszenz-Signale in Gruppe Behandlung mit Liposomen allein, ALA-Behandlung allein und siRNA-Behandlung allein ergab für alle Zeitpunkte (140 Minuten bis 320 Minuten nach Behandlung) keine deutliche Markierung der Tumoren. Im Gegensatz dazu erreichte die PpIX-Fluoreszenz im Tumor von Mäusen, die mit FECH-1140 siRNA und ALA behandelt wurden (0.1 nmol siRNA / g Körpergewicht und 20 mg ALA /kg) 140 Minuten nach der Behandlung mit ALA maximale Fluoreszenzwerte. Der Kontrast im Abdominalbereich stammt von im Futter enthaltenen Fluorophoren.

• PD Dr. W. Kemmner, Chirurgie und Chirurgische Onkologie,
  Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC), Berlin-Buch
  
  
• Charité Comprehencive Cancer Center (CCCC), Berlin