Physikalisch-Technische Bundesanstalt

Die Fluoreszenzspektroskopie ist aufgrund ihrer hohen Nachweisempfindlichkeit und Selektivität eine etablierte Messmethode in der quantitativen Analytik. Ein Vergleich von Fluoreszenzmessungen mit verschiedenen Messsystemen ist jedoch nur möglich, wenn man die gerätespezifischen Einflüsse auf das Fluoreszenzsignal korrigiert. In einer engen Kooperation zwischen der PTB, der Bundesanstalt für Materialforschung und ­prüfung (BAM) und zwei Industriepartnern ist es gelungen marktreife spektrale Fluoreszenzstandards zu entwickeln und zu zertifizieren. Damit lassen sich gerätespezifische Einflüsse schnell, einfach und radiometrisch rückführbar korrigieren.

Abbildung 1: Titelblatt des Zertifikats ,, Kalibriersatz Spektrale Fluoreszenzstandards"

Fluoreszenzspektroskopische Methoden haben sich in den so genannten ,,life sciences" wie z.B. der medizinischen Diagnostik, der Bioanalytik und der Umweltanalytik als quantitative analytische Methode durchgesetzt. Dieser breit gefächerte Anwendungsbereich hat zur Folge, dass sich eine Vielzahl von unterschiedlichen kommerziellen Fluoreszenz-Messsystemen auf dem Markt etabliert hat. Fluoreszenzmessdaten, die an verschiedenen Messsystemen gewonnen wurden, lassen sich jedoch nur miteinander vergleichen, wenn die geräte-spezifischen Beiträge bekannt sind und korrigiert werden können.

Im Rahmen eines vom Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie geförderten Projekts wurde in einer engen Kooperation zwischen der PTB, der Bundesanstalt für Materialforschung und ­prüfung (BAM) sowie den Firmen Gigahertz-Optik GmbH und Sigma-Aldrich GmbH ein radiometrisches, auf Primärnormale rückführbares Verfahren entwickelt, das es ermöglicht den gerätespezifischen spektralen Empfindlichkeitsverlauf des Nachweiskanals aus den gemessenen Fluoreszenzspektren zu eliminieren.

Die radiometrische Rückführung wird mittels dreier wesentlicher Elemente realisiert. Erstens einem an die Anforderungen der Fluorometrie angepassten Strahldichtenormal. Dazu wurde ein neuartiges Strahldichtenormal in Form eines kompakten, homogen und mit nahezu Lambert'scher Abstrahlcharakteristik leuchtenden Ulbrichtkugelstrahlers entwickelt, dessen spektrale Strahldichte im Vergleich zu einer Wolframbandlampe um mehrere Größenordnungen reduziert wurde. Damit erreicht man eine bessere Anpassung des Normals an die Strahldichte der fluoreszierenden Probe.


Abbildung 2: Kompakter Ulbrichtkugelstrahler als Strahldichtestandard für die radiometrische Rückführung in der Fluorometrie (links). Rechts ist die Verteilung der Strahldichte über die strahlende Fläche bei einer Wellenlänge von 650 nm dargestellt. Ein Farbumschlag entspricht einer relativen Änderung von 0,5 %

Als zweiter Bestandteil der radiometrischen Rückführung wird ein hochwertiges Referenzfluorometer verwendet, dessen spezieller optischer Aufbau die quantitative Messung von Fluoreszenzspektren unter Vermeidung von Abbildungsfehlern ermöglicht. Die Kalibrierung des Nachweiskanals dieses Referenzfluorometers mit dem oben genannte Strahldichtenormal erlaubt die Zertifizierung der Fluoreszenzspektren von Referenzmaterialien mit kleiner Messunsicherheit.

Abbildung 3: Schematische Darstellung des BAM-Referenzfluorometers für die Zertifizierung der Fluoreszenzspektren von Referenzmaterialien

Letzter und für den Anwender relevanter Teil der radiometrischen Rückführung ist der Kalibriersatz Spektrale Fluoreszenzstandards BAM-F001 ­ BAM-F005. Er besteht aus fünf Farbstoffen, deren korrigierte Emissionspektren im Januar 2006 von der BAM zertifiziert wurden. Damit wird es auch dem radiometrisch unerfahrenen Anwender ermöglicht, durch eine einfache, schnelle und rückführbare Messung die relative spektrale Empfindlichkeit des Nachweiskanals von Fluoreszenzmesssystemen unter applikationsrelevanten Bedingungen zu ermitteln und zu korrigieren.

Abbildung 4: Kalibriersatz ,,Spektrale Fluoreszenzstandards" und die zugehörigen zertifizierten Fluoreszenzspektren zur Ermittelung der relativen spektralen Empfindlichkeit von Fluoreszenzmesssystemen.

• J. Hollandt, R.D. Taubert, J. Seidel, U. Resch-Genger, A. Gugg-Helminger, D. Pfeifer, C. Monte, W. Pilz: Traceability in Fluorometry ­ Part I: Physical Standards, Journal of Fluorescence, Vol. 15, No. 3, 2005, 301-313
• U. Resch-Genger, D. Pfeifer, C. Monte, W. Pilz, A. Hoffmann, M. Spieles, K. Rurack, J. Hollandt, D. Taubert, B. Schönenberger, P. Nording: Traceability in Fluorometry ­ Part II: Spectral Fluorescence Standards, Journal of Fluorescence, Vol 15, No. 3, 2005, 315-336

Dr. Jörg Hollandt
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